Nội dung phim: Câu chuyện bắt đầu khi Viện bảo tàng Lịch sử Tự nhiên được đóng cửa để trùng tu và nâng cấp, các hiện vật và mẫu tượng tại đây được chuyển đến kho dự trữ liên bang ở Viện Smithosnian nổi tiếng ở Washington. Larry Daley hiện là một nhà sáng chế, kinh doanh lương thiện và không còn làm việc gác bảo tàng ban đêm nữa, nhưng khi biết tin các bạn cũ – tượng Cựu tổng thống Roosevelt và chàng cao bồi Jedediah đang gặp nạn tại nơi ở mới, Daley không ngần ngại thâm nhập vào Smithsonian để giúp một tay. Và một lần nữa, Larry Daley lại trải qua một đêm kinh hoàng tại bảo tàng với sự nổi loạn của các hiện vật tại đây.
